Membuat Larutan Stock B dan E

BAB I

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Teknik kultur jaringan tanaman merupakan cara yang berguna untuk belajar dasar dan aplikasi pemeliharaan dan perbanyakan tanaman khususnya untuk bioteknologi. Kultur jaringan tanaman dengan luas mengacu kepada pengolahan bagian tanaman secara in vitro. Teknik ini banyak digunakan sebab teknik ini sederhana dan lebih mudah untuk pengamatan suatu tanaman.

Beberapa cara memperoleh tanaman untuk menggunakan teknik kultur jaringan yaitu mengambil bagian kecil dari suatu tanaman. Metode ini juga disebut perbanyakan mikro (micro propagation). Tanaman memerlukan nutrisi dan vitamin untuk dapat tumbah pada teknik kultur jaringan tanaman.
Biasanya setiap tanaman mempunyai kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhannya. Inti dari teknik kultur jaringan yaitu menyediakan nutrisi dengan media yang tepat untuk pertumbuhan eksplan. Masa kini banyak media yang dibuat khusus untuk penyediaan nutrisi bagi eksplan, salah satunya yaitu media MS (Murashige and Skoog) yang merupakan median yang paling banyak digunakan untuk teknik kultur jaringan.

1.2. Tujuan

Praktikum kultur jaringan tanaman acara pembuatan media bertujuan untuk:
1.   Mengetahui media yang digunakan dalam kultur jaringan

2.      Mengetahui cara membuat media MS

3.      Mengetahui bahan-bahan yang digunakan dalam membuat media MS

BAB II

 TINJAUAN PUSTAKA

Kultur jaringan merupakan suatu rangkaian prosedur untuk memelihara dan menumbuhkan sel tanaman (dapat berupa kalus, sel, protoplas) dan organ (batang, akar, embrio) secara aseptik. Aseptik disini berarti bebas dari kontaminasi mikroba.

Tujuan utama kultur jaringan tanaman yaitu untuk perbanyakan bagian tanaman. Perbanyakan dapat dilakukan dengan cara merangsang pertumbuhan tunas cabang dan percabangan aksiler atau merangsang terbentuknya tunas pucuk tanaman secara adventif, baik secara langsung maupun kalus terlebih dahulu. Bagian-bagian tanaman dapat tumbuh secara optimal apabila menggunakan media tepat yang digunakan untuk pemenuhan nutrisi tanaman. Media yang digunakan harus mengandung mineral, gula, vitamin dan hormon dengan perbandingan yang dibutuhkan secara tepat. Media perlu ditambahkan agar untuk mendapatkan media semi padat yang fungsinya untuk meletakkan atau membenamkan jaringan tanaman (Wetherell, 1976).

Menurut Prakash et al. (2004), pertumbuhan tanaman in vitro sebagian besar dipengaruhi oleh komposisi media kultur. Komponen media yang utama dalam kultur jaringan tanaman yaitu garam, mineral dan gula sebagai sumber karbon dan air. Komponen lain merupakan tambahan organik, pengatur pertumbuhan, gell agar. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan antara lain Murashige dan Skoog (MS), Linsmaier dan Skoog (LS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dan lain-lain. Meskipun beberapa jumlah komposisi dirubah untuk langkah-langkah kultur jaringan dan spesies tanaman berbeda, media MS (Murashige dan Skoog, 1962) dan LS (Linsmaier dan Skoog, 1965) paling banyak digunakan dalam kultur jaringan tanaman.

Setiap unsur yang terkandung dalam media mempunyai fungsi bagi metabolisme tanaman atau proses kultur jaringan. Media yang digunakan untuk kultur sel dalam bentuk larutan nutrisi, padat dan cair. Media MS sebagai media fundamental yang mengandung nutrisi makro anorganik, nutrisi mikro anorganik, nutrisi Fe, vitamin, organik dan zat pengatur pertumbuhan tanaman (phytohormon). Phytohormon yang paling banyak digunakan dalam kultur jaringan tanaman (khususnya media MS) yaitu (Storr, 1985):

1.      Auksin : NAA, IAA dan 2,4 D

2.      Sitokinin : BAP dan Kinetin

Komposisi nutrisi makro anorganik mempunyai fungsi, khususnya untuk metabolisme tanaman. Komposisi tersebut mengandung protein, karbohidrat, asam nukleat, lipid dan lain-lain. Unsur-unsur nutrisi makro anorganik dalam media MS antara lain:

1.      KNO3

2.      NH4NO3

3.      CaCl2.H2o

4.      MgSo4.7H2O

5.      KH2PO4

Sedangkan unsur-unsur nutrisi mikro anorganik dalam media MS antara lain:

1.      MnSO4.4H2O

2.      ZnSO4.4H2O

3.      H3BO3

4.      Kl

Salah satu unsur Fe berasal dari komponen nutrisi mikro anorganik. Unsur Fe dikatagorikan dalam larutan stok C karena nutrisi ini tidak dapat larut dengan unsur lain. Oleh karena itu, Fe harus dipisahkan dari unsur lain.

Vitamin yang digunakan dalam media MS hanya thiamine (vitamin B1). Komponen ini diperlukan untuk metabolisme karbohidrat dan biosintesis dari asam amino. Vitamin telah terbukti sebagai komponen yang penting dalam kultur jaringan tanaman. Vitamin lain yaitu seperti vitamin C dan vitamin E hanya digunakan jika diperlukan untuk pertumbuhan eksplan maksimum. Unsur organik dalam media MS seperti sukrosa atau gula lain menambahkan ke dalam media untuk menyediakan CO2.

BAB III

METODOLOGI

3.1. Tempat dan Pelaksanaan

Pelaksanaan pada tanggal 1 oktober 2014 pukul 11.00 s/d 13.00 Wib tempat praktikum di laboraturium kultur jaringan Politeknik Negeri Jember.

3.2. Bahan dan Alat

A. Bahan
1. Larutan Stok A (nutrisi makro)
a. KNO3
b. NH4NO3
c. CaCl2.H2o
d. MgSo4.7H2O
e. KH2PO4

2. Larutan Stok B (nutrisi mikro)
a. MnSO4.4H2O
b. ZnSO4.4H2O
c. H3BO3
d. Kl
e. NaMoO4.2H2O
f. CuSO4.5H2O
g. CoCl2.6H2O

3. Larutan Stok C (nutrisi Fe)
a. FeSO4.7H2O
b. Na2EDTA 4. Larutan Stok D
a. Myo-inositol
b. Thiamine-HCl
c. Nicotinic acid
d. Pyridoxine-HCl
e. Glycine

5. Larutan Stok E (IAA)

6. Larutan Stok E (Kinetin)

7. Thiamine

8. Sukrosa

9. Asam amino

10. Akuades

11. Agar

12. HCl

13. NaOH

B. Alat
1. Stirrer magnetic
2. Stirrer
3. Plastik
4. Karet gelang
5. Alumunium foil
6. Timbangan analitik.
7. pH meter

8. Pipet

9. Kompor
10. Kertas tisu

3.3. PROSEDUR KERJA

pembuatan larutan Stock Medium Murashige dan Skoong (MS) yang di praktikum pada kelompok saya adalah membuat Larutan Larutan B dan E

1.      Larutan Stock B

·         Timbang Garam KNO3 sebnayak 19.000 mg dengan gelas piala 50 ml

·         Larutan garam tersebut dalam piala yang sama dengan 50 ml aquadest.

·         Tuangkan larutan tersebut kedalam erlenmeyer/botol reagen ukuran 200 ml dan bilasnya 2-3 kali sehingga sisa larutan garam dalam gelas piala habis.

·         Tambahkan aquadest kedalam erlenmeyer/botol reagen sampai volumenya menjadi 200 ml. Selanjutnya tutup dengan aluminium foil.

·         Beri lebel B pada erlenmeyer/botol reagen tersebut.

·         Simpan larutan stock B pada ruang gelap pada suhu kamar.

·         Bersihkan alat-alat yang habis di pakai, bilaslah dengan air kran =, kemudian dengan aquadest.

2.      Larutan Stock E

·           Timbang garam 14.800 mg MgSO4.H2O dan 6800 mg KH2PO4 masing-masing dengan gelas piala 50 ml.

·           Larutan garam tersebut dalam gelas piala yang sama dengan 50 ml aquadest.

·           Tuangkan larutan tersebut kedalam erlenmeyer/botol reagen ukurannya 200 ml dan bilaslah 2-3 sehingga sisa larutan garam dalam gelas piala habis.

·           Tambahkan aquadest kedalam erlenmeyer/botol reagen sampai volemennya menjadi 200 ml. Selanjutnya tutup dengan aluminium foil.

·           Simpan larutan stock B pada ruang gelap pada suhu kamar. Karena larutan ini tidak tahan akan cahaya atau rusak karena cahaya, sebaiknya di simpan di ruang tertutup dimana cahaya tidak dapat masuk dan lebih baik lagi di simpan dalam lemari es.

·           Bersihkan alat-alat yang habis do=ipakai, bilaslah dengan air keran, kemudian dengan aquadest.

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

1. Larutan Stok A (nutrisi makro)
a. KNO3
b. NH4NO3
c. CaCl2.H2o
d. MgSo4.7H2O
e. KH2PO4

2. Larutan Stok B (nutrisi mikro)
a. MnSO4.4H2O
b. ZnSO4.4H2O
c. H3BO3
d. Kl
e. NaMoO4.2H2O
f. CuSO4.5H2O
g. CoCl2.6H2O

3. Larutan Stok C (nutrisi Fe)

FeSO4.7H2O

Na2EDTA

4. Larutan Stok D

Myo-inositol
Thiamine-HCl
Nicotinic acid
Pyridoxine-HCl
Glycine

5. Larutan Stok E (IAA)
6. Larutan Stok E (Kinetin)
7. Thiamine
8. Sukrosa 6%
9. Asam amino
10. Akuades
11. Agar
12. HCl
13. NaOH

B. Pembahasan

Tahun 1962 Murashige dan Skoog memperkenalkan hasil temuannya berupa komposisi media kultur yang terdiri dari unsur makro, unsur mikro, vitamin dan asam amino pada konsentrasi tertentu. Temuan ini dikenal dengan nama media Murashige dan Skoog (MS). Media MS (Murashige dan Skoog) merupakan media universal yang paling umum digunakan pada kegiatan kultur jaringan tanaman.

Praktikum pembuatan media kali ini menggunakan media MS. Media MS yang dibuat mengandung nutrisi makro anorganik, nutrisi mikro anorganik, nutrisi Fe, vitamin, organik dan zat pengatur tumbuh tanaman (phytohormon). Komposisi nutrisi makro yang digunakan adalah:

1.      KNO3

2.      NH4NO3

3.      CaCl2.H2O

4.      MgSO4.7H2O

5.      KH2PO4

Komposisi ini mengandung : N (KNO3 dan NH4NO3); K (KNO3 dan KH2PO4); P ( KH2PO4), Ca (CaCl2.H2O); Mg (MgSO4.7H2O) dan S ( MgSO4.7H2O) unsur kimia ke dalam pertumbuhan tanaman. Unsur nitrogen ditambahkan dalam jumlah besar dibandingkan dengan unsur yang lain karena tanaman membutuhkan nutrisi tersebut dalam jumlah besar untuk pertumbuhan vegetatif (Prakash et al, 2004).

Nutrisi mikro yang digunakan dalam praktikum kali ini dalam bentuk nutrisi stok B yaitu MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3 and KI. Nutrisi mikro dalam kultur jaringan tanaman menggunakan konsentrasi molar yaitu Fe, Mn, Zn, B, Cu dan Mo. Fe dapat diperoleh dari larutan stok C karena unsur ini sangat reaktif dengan unsur lain dan cahaya.

Agar dan gula diperlukan untuk pembuatan media. Bubuk agar perlu untuk media pembuatan menjadi semi padat. Diperlukan pemanas untuk mencairkan bubuk agar dan media MS cair sampai mendidih. Gula berfungsi ganda di dalam media yaitu berfungsi sebagai sumber energi dan sebagai penyeimbang tekanan osmotik media. Menurut George & Sherrington (1984) dalam Anonim (2009), 4/5 bagian dari potensial osmotik dalam media White disebabkan oleh gula, sedangkan dalam media MS hanya 1/2 dari potensial osmotiknya disebabkan adanya gula.

Sebelum media dipanaskan harus diperiksa pH nya terlebih dahulu. Media sangat baik pada pH 5,8 jika pH kurang dari 5 media agar akan terlalu lemah, tetapi jika pH di atas 7 media agar terlalu padat dan tidak bisa penanaman eksplan dengan baik. Faktor penting adalah pH yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor (Anonim, 2009):

1.      Kelarutan dari garam-garam penyusun media

2.      Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain

3.      Efisiensi pembekuan agar.

Untuk menghindarkan perubahan pH yang cukup besar. Murashige dan Skoog menyarankan agar dilakukan pemanasan untuk melarutkan agar-agar dan memanaskan media di dalam autoklaf selama beberapa menit, baru diadakan penetapan media disterilkan dalam autoklaf. Dalam wadah yang besar, media disterilkan dan kemudian dititrasi dengan NaOH/HCl steril sampai pH yang diinginkan. Setelah itu media dituang ke dalam wadah kultur steril yang telah dipersiapkan di dalam Laminar Air Flow cabinet.
Keuntungan dari pemakaian agar adalah (Anonim, 2009):

1.      Agar membeku pada temperatur ≤ 45o C dan mencair pada temperatur 100o C, sehingga dalam kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil.

2.      Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman.

3.      Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media.

Setiap jenis vitamin mempunyai fungsi yang berbeda-beda di dalam tubuh tanaman antara lain:

1.      Inositol (vit. B) bagian dari berbagai macam membran (kloroplas).

2.      Thyamin (vit. B1) berperan sebagai ko-enzim dari siklus krebs.

3.      Nicotinic acid (niacin) berperan dalam fotosintesa.

4.      Pyridoxine (vit. B6) berperan sebagai ko-enzim pada beberapa enzim.

5.      Pantothenic acid (a vit. B) berperan sebagai ko-enzim dalam metabolisme lemak.

6.      Riboflavin (vit. B12) berperan sebagai ko-enzim reseptor sinar biru.

7.      Biotin (vit. H) berperan sebagai ko-enzim dalam metabolisme lemak.

BAB VI

SIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1.      pembuatan larutan Stock E harus di tutup rapat Karena larutan ini tidak tahan akan cahaya atau rusak karena cahaya, sebaiknya di simpan di ruang tertutup dimana cahaya tidak dapat masuk dan lebih baik lagi di simpan dalam lemari es.

2.      Media yang banyak digunakan dan media yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah media Murashige dan Skoog (MS).

3.      Pembuatan media harus memerhatikan pH yang terkandung dalam media, karena pH berpengaruh kepada sifat media.