STERILISASI ALAT DAN RUANG LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptic sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. Bertolak dalam definisi tersebut, maka keberhsilan dalam kultur jaringan di tentukan oleh; keterampilan pekerj, sterilitas media yang di gunakan, kondisi ruang kerja (ruang transfer) yang di gunakan serta kondisi peralatan yang di pakai.

Ruang (ruang transfer/penabur) dalam teknologi kultur jaringan mutlak harus dalam kondsi steril, tanpa kondisi demikian tingkat keberhasilan dalam kultur jaringan akan rendah. Sterilisasi ruang dapat dilakukan dengan menyemprot ruangan dengan alkohol 70% sedangkan sterilisasi lantai di lakukan dengan alkohol atau dengan larutan desifektan lainnya. (BKPM Kultur jaringan dasar edisi-2)

Sterilisasi ditujukan agar terjadi denaturasi protein dan terutama tidak aktifnya enzim yang digunakan untuk metabolisme bakteri,dan perlakuan panas ditujukan untuk membunuh spora bakterinya. Sterlisasi pada medium dan alat-alat bertujuan untuk mencegah adanya bakteri yang tidak diinginkan dalam pemiaraan (Waluyo, 2008).

1.2  Tujuan

Yang dapat di ambil dari praktikum kuljar pada minggu ini adalah sebagai berikut:

1.      Melakukan sterilisasi ruang, peralatan dan media yang digunakan dalam kultur jaringan.

2.      Menjaga kebersihan ruang dan alat laboratorium yang akan digunakan

3.      Menambah pengetahuan mengenai alat dan ruang yang aseptik

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Sterilisasi Bagian yang sangat penting dalam teknik in vitro adalah sterilisasi bahan tanaman dan media dan menjaga kondisi aseptik yang telah dicapai. Bakteri dan jamur adalah dua kontaminan yang paling banyak dijumpai dalam kultur. Spora jamur sangat ringan dan ada disekeliling lingkungan. Apabila spora jamur kontak dengan media kultur dan kondisinya optimal untuk perkecambahan jamur, maka akan terjadi kontaminasi.

a.    Sterilisasi Ruang Kultur dan Transfer

Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet (UV). Waktu sterilisasi bervariasi tergantung dari ukuran ruang transfer itu sendiri dan harus dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. Radiasi UV sangat berbahaya bagi mata dan kulit. Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida) komersial.

Ruang kerja dalam laminar flow biasanya sudah dilengkapi dengan lampu UV, sehingga sterilisasinya dilakukan dengan UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam laminar dengan alkohol 70% sebelum mulai bekerja. Ruang kultur harus dibersihkan dengan sabun kemudian dilap dengan Na-hypoklorit 2% (merek komersial seperti Sunclin, Bayclin atau pembersih lantai lain yang mengandung disinfektan) atau alkohol 70%. Lantai ruangan dan dinding harus dibesihkan seminggu sekali dengan bahan yang sama.

b.    Sterilisasi Peralatan Gelas dan Peralatan Lain. 

Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o-170oC selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170oC. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen.

Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit.

c.    Sterilisasi Media 

Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile.

Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi dengan filter. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave.

Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile, dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave, kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar), (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril, larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik.

d.   Sterilisasi Bahan Tanaman 

Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal yang sulit. Meskipun bermacam tindakan pencegahan sudah dilakukan, 95% kultur akan mengalami kontaminasi apabila eksplan tidak didisinfeksi. Organ atau jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan disinfektan, karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara pemanasan yang ekstrim.

Tidak ada metoda yang baku untuk sterilisasi eksplan, sehingga waktu perendaman dalam larutan disinfektan merupakan kisaran karena tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan disterilisasi. Larutan yang digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat membunuh kontaminan baik bakteri maupun jamur. Untuk tanaman berkayu, umbi dll. biasanya sebelum disterilisasi dengan larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas dengan air mengalir, tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous. Semua permukaan eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam sterilan, dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril sekurang-kurangnya tiga kali.

Di dalam memulai melakukan kegiatan kultur jaringan diperlukan ruang dan peralatan. Ukuran ruang yang diperlukan dapat disesuaikan dengan volume aktivitas kultur jaringan yang akan dilakukan. Ruang yang diperlukan untuk kegiatan kultur jaringan yaitu laboratorium yang ideal yang memiliki:

1)      Ruang persiapan yang di dalamnya terdapat timbangan analitik, lemari pendingin, hotplate, mikrowave, oven, pH meter, alat-alat gelas standar (labu takar, pipet volume, erlenmeyer, gelas piala, batang pengaduk dari gelas, dan wadah kultur), alat untuk mencuci (washtaple), lemari untuk alat dan bahan kimia, sentrifuse, fumehood, destilator, dan kereta dorong;

2)      Ruang transfer yang di dalamnya terdapat laminar air flow, dissecting, mikroskop, alat diseksi, lemari tempat penyimpanan alat-alat steril, dan timbangan kecil.

3)      Ruang kultur yang dilengkapi dengan rak kultur dan lampu fluorescent, timer untuk mengatur lama penyinaran, AC untuk mengontrol temperatur, mikroskop binokuler, dan shaker (Barahima, 2011).

Peralatan yang mutlak dimiliki untuk memulai melakukan kegiatan kultur jaringan yaitu: timbangan analitik, destilator, pH meter, autoclaf, laminar air flow, dan gelas-gelas standar. Peralatan ini kemungkinan dapat menimbulkan resiko pada pemakainya atau menimbulkan kerusakan apabila salah prosedur dalam mengoperasikannya (Barahima, 2011).

Medium yang digunakan untuk kultur jaringan tanaman dapat  berupa medium padat atau cair. Medium padat digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutkan diinduksi membentuk tanaman yang lengkap, sedangkan medium cair biasanya dugunakan untuk kultur sel. Medium yang diggunakan mengandung lima komponen utama, yaitu senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh dan suuplemen organik (Adnan, 2011).

Sterilisasi adalah istilah mutlak yang artinya mematikan semua bentuk kehidupan pada suatu daerah. Sehingga dalam sterilisai nanti alat-alat tidak terkontaminasi dengan pihak luar. Sterilisasi terbagi menjadi dua, yaitu:

1)      Sterilisasi basah ,yaitu sterilisasi yang menggunakan autoklaf dengan temperatur 121˚C tekanan 1 atm/0,15 Mpa selama 15-20 menit.

2)      Sterilisasi kering, yaitu sterilisasi yang menggunakan oven dengan temperatur 160-170˚C. Selama kurang lebih 2 jam.

BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1  Waktu dan Tempat

Praktikum sterilisasi alat dan ruang dilaksanakan pada :

Hari/tanggal    : Rabu, 17 September 2014

Waktu                         : 11.00 – 13.00 WIB

Tempat            : Laboratorium Kultur Jaringan Politeknik Negeri Jember

3.2  Alat dan bahan

alat yang digunakan :

ü  bulpoin ü  kertas ü  botol kultur media ü  botol kultur kosong ü  petridish ü  kain lap ü  kertas CD/tissue ü  lap bersih ü  tutup botol

ü botol stok aquades ü oven ü autoclave ü semprotan ü kain pel-pelan/ ü sapu ü spons ü sikat ü guntung, pinset

 bahan yang digunakan :

ü  sabun air

ü  air / aquades

ü  alkohol 70 %

ü  supersol/wipol  5%

ü  formalin 10 %

3.3  Prosedur Kerja

a.       Sterilisasi alat gelas standart

1.      Botol dicuci bersih dengan sabun cair menggunakan spons dan sikat hingga bersih lalu bilas dengan air bersih

2.      Botol dikering anginkan dengan menggunakan lap bersih, susun rapi kedalam oven

3.      Lalu masukkan ke dalam autoclave pada suhu 121­^o C selama 60 menit pada tekanan 175 psi (pound per square inch)

4.      Untuk botol-botol yang mempunyai tutup autoclaveable,jangan ditutup terlalu kencang karena selama pemanasan terjadi pemuaian

5.      Alat-alat yang disterilkan sebelum pemanasan adalah pinset,gunting,kertas saring, petridish,botol kosong,pipet

6.      Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kantong plastik yang disealer sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Alumunium foil tidak dianjurkan sebagai pembungkus karena uap air tidak dapat masuk kedalam pembungkus.

7.      Alat-alat seperti pinset,gunting,gagang scalpel dibungkus dengan plastik yang telah disealer

8.      Petridish dan tutup botol disterilkan dengan pembungkus plastik yang sudah disealer

9.      Selanjutnya autoclave dibuka dan peralatan yang telah disterilisasi diambil

10.  Kering anginkan semua peralatan,simpan dengan rapid an ditempat yang bersih

              B. Sterilisasi Ruang

1.      Sapu bersih lantai dan dinding ruang transfer dengan sapu yabg telah di sediakan

2.      Pel lantai dengan larutan desinfektan (alkohol 90%-70% larutan phenol, dll)

3.      Semprot diding ruang dengan alkohol 95-70%  tau cukup dengan lampu UV(Ultra Violet) bila ada selam satu jam sebelum ruang tersebut di pergunaan

4.      Di dalam sterilisisasi ruangan, untuk semua ruangan kultur jaringan di bersihakan dan di gunakan alkohol 70% dan di semprot dengan formalin 5% ke seluruh ruangan tersebut.

C. Sterilisasi Botol kuljar (dari gelas)

1.      Rendam botol kultur ke dalam bak yang berisi air yang telah di beri ditergen secukupnya agar kotoran mudah menghilan.

2.      bersihkan botol-botol kultur dari semua kotoran (sisa label dan kotoran lainnya dengan menggosok menggunakan sikat pembersihan botol.

3.      Bilas botol yang teah di cuci dengan air bersih/air mengalir agar sisa diterge hilang

4.      Taruh botol-botol yang telah di cuci dalam posisi terbalik dalam bak agar cepat atus, serta botol-botol tersebut di lap dengan kain bersih.

5.      Seterilkan botol-botol kultur dengan cara memanasakan ke dalam oven pada suhu 160^oC selama + 2-3 jam.

6.      Bersihkan tempat penyimpanan botol kultur (dari gelas) dengan menyemprot alkohol 70%  agar tempat tersebut tetap steril.

7.      Setelah botol selesai dari oven tunggu sebentar, agar semua botol kultur tersebut dingin dan di pindahkan ke tempat yang telah di sediakan pada poin ke 6 serta dalam penyusuanan di lakukan penumpukan dengan cara miring.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.  Hasil

Beberapa jenis peralatan yang disterilisasi menggunakan autoclave diantaranya adalah:

v  Petridish: digunakan sebagai tempat meletakkan eksplan di LAF sebelum dilakukan penanaman

v  Botol kultur media : digunakan sebagai botol tempat menanam eksplan

v  Botol kultur kosong : untuk menyimpan media 80 buah yang telah di setrilkan

v  Erlenmayer : digunakan untuk menyipan larutan stok

v  Scalpel : digunakan untuk memotong eksplan

v  Alumunium foil : digunakan untuk menutup botol kultur/melindungi larutan stok dari cahaya matahari secara langsung

v  Kertas saring satu set

v  Kertas CD sepuluh bungkus

Ruangan yang disterilkan adalah ruangan laboratorium kultur jaringan yang meliputi :

v Ruang penyimpanan alat dan bahan

v Ruang penyimpanan media

v Ruang inkubasi

v Ruang transfer

4.2 Pembahasan

Dalam praktikum ini membahas tentang bagaimana melakukan sterilisasi ruang alat dan media kultur, adapun jenis jenis sterilisasi yang digunakan adalah:

·       Sterilisasi ruang laboratorium kultur jaringan

·       Sterilisasi alat-alat laboratorium kultur jaringan

Pada prosedur pelaksanaan sterilisasi ruang dapat melakukan beberapa cara sebagai berikut;

·         Dapat  menhidupkan UV Lampu selama  1 jam

·         Melakukan pembersihan terhadap semua kotoran dan debu

·         Dan dapat juga melakukan kegiata fumigasi dengan larutan disinfectant dan formalin

Adapun bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi ruang adalah formalin, alcohol dan disinfectant.

a.    Selain membahas tentang sterilisasi ruang disini juga akan membahas tentang prosedur sterilisasi alat. Pada peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130^o-170^oC selama 2-3 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170^oC. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak disarankan untuk bahan yang terbuat dari metal karena akan menyebabkan karat.

b.    Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 70% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121^oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit. Setelah selesai, selanjutnya alat tersebut di masukan ke dalam LAC atau oven.

c.    Pada sterilisasi media dan air dapat menggunakan dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter.

d.   Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121^oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile.

e.    Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi dengan filter. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave.

f.     Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile, dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave, kemudian didinginkan sampai suhu 50-60^oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar), (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril, larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilaksanakan dapat ditarik kesimpulan bahwa :

Sterilisasi ruang dan alat-alat laboratorium kultur jaringan perlu dilakukan karena merupakan  hal terpenting untuk keberhasilan dalam kultur jaringan dengan kondisi lingkungan yang aseptik. Serta di dalam kondisi ruangan yang telah di semprot formalin harus di tinggalkan kurang lebih 24 jam agar di dalam ruangan tetap seteril dan manusia yang masuk tidak menghirup bahan formalin tersebut.

1)      adapun jenis jenis sterilisasi yang digunakan adalah:

·      Sterilisasi ruang kerja lab.kultur jaringan

·      Sterilisasi gren house kultur jaringan

·      Sterilisasi alat-alat lab.kultur jaringan

2)      Dengan menggunakan autoclave, sterilisasi alat menggunakan pada suhu 121­^o C selama 60 menit pada tekanan 175 psi (pound per square inch)

5.1 Saran

Sterilisasi adalah salah satu langkah untuk memulai kegiatan kultur tanaman yang di dalamnya alat-alat dan bahan yg harus steril, namun di dalam kegiatan tersebut user harus berhati-hati dan teliti agar alat-alat tersebut tidak rusak. Di dalam pembuatan laporan mahasiswa di larang copas oke by ruadi maha putra.

DAFTAR PUSTAKA

Djenal, (BKPM) dasar-dasar kultur jaringan tanaman edisi-2. Politeknik Negeri Jember; Jember 2014

Marlin, dkk. 2012. Penuntun Praktikum Kultur Jaringan. Fakultas Pertanian Universitas Bengkulu, Bengkulu.

anaktptph-agriculture.blogspot.com

Nugroho, A dan H. Sugianto. 1997. Pedoman Pelaksanaan Tehnik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya, Jakarta.

Wattimena, G. A. 1992. Bioteknologi Tanaman. IPB, Bogor.